Descripción del servicio
El servicio ofrece el procesado y molienda de las muestras, la preparación de extractos proteicos en dos modalidades (secuencial o total) y el análisis HPLC también en dos modalidades (en función del tipo de extracción). El protocolo es el descrito por Pistón et al. (2011) con ligeras modificaciones.
- Procesado de muestras:
Recepción de las muestras, peso en fresco, submuestrear si procede y, conservación a -80ºC.
Liofilización y pesado posterior para obtener contenido en agua.
Molienda: Obtención de las harinas en molino ciclónico, cribadas con malla de 500 micras (las muestras pequeñas se muelen en molino de bolas).
Submuestreo: 100 mg de cada una de las muestras recibidas por triplicado
- Preparación de extractos:
La fracción de gliadinas se obtiene a partir de 100 mg de harina a los cuales se le añaden 670 µl de etanol al 60% (v / v) y se agitan en molino de bolas a amplitud máxima durante 15 segundos hasta conseguir mezclar bien la harina con el tampón. Transcurrido este tiempo, se reduce la frecuencia al mínimo y se mantiene en agitación durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifuga 15 minutos a 6000 x g a RT, e inmediatamente, se recupera el sobrenadante. Sobre el pellet resultante se repite la etapa completa 2 veces más y los sobrenadantes de una muestra se mezcla en un único tubo (volumen final de extracción: 2mL).
La fracción de gluteninas se extraen del pellet insoluble con 500 µl de 1-propanol al 50% (v /v), urea 2 M, Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5) y DTT al 2% (p /v). Seguidamente, se agita durante 15 s minutos a una amplitud máxima en un molino de bolas a temperatura ambiente y se incuba durante 30 minutos a 60ºC en un agitador orbital. Tras la incubación, se centrifuga durante 15 minutos a 6000 x g a RT y se recupera el sobrenadante. Como en el caso de las gliadinas, este proceso se repite dos veces más, uniendo todos los sobrenadantes en un único tubo (volumen final de extracción: 1,5mL).
-Análisis HPLC de extractos proteicos.
Los extractos tanto de gliadinas como de gluteninas requieren ser filtradas antes de introducirlos en el RP-HPLC, por lo que se centrifugan a través de un filtro de 0,45 µm de diámetro de poro (Corning® Costar® Spin-X®). Finalmente se pasan a un vial de cromatografía.
Los extractos de gliadinas (60 µl) y gluteninas (60 µl) se analizan en una columna analítica de fase inversa Agilent Zorbax 300SB-C8(4,6 x 250 nm, tamaño de partícula de 5 µm, tamaño de poro de 300 Å) utilizando un sistema cuaternario de cromatografía líquida de alta resolución serie 1200 (Agilent Technologies) con un detector DAD UV-V. El sistema de elución consiste en agua desionizada (A) y acetonitrilo (B), ambos conteniendo 0,1 % (v/v) de ácido tricloroacético. Las proteínas se separan con un gradiente lineal de 24 % B a 56 % B en 60 min tanto para gliadinas como para gluteninas, a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min a 50ºC. Se detectan con el módulo DAD UV-V a 210 nm. El software estima de forma automática la integración con algunos ajustes manuales menores. Se determinan las cantidades absolutas de la fracción de gliadina y glutenina usando albúmina de suero bovino (BSA, BSA ¿98%, fracción V.Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA, cat. No. A3294) como patrón de proteínas. Se llevan a cabo 3 repeticiones para cada muestra analizada.
*Piston F., Gil-Humanes J., Rodríguez-Quijano M. and Barro F. (2011) Down-regulating g-gliadins in bread wheat leads to non-specific increases in other gluten proteins and has no major effect on dough gluten strength. PLoS ONE, 6, e24754.
Cuadro de opciones y precios
| Opciones |
Unidad |
Sector Público |
Otros Clientes |
| Análisis HPLC: total prolaminas |
€ / muestra |
52.95 € |
58 € |
| Extracción total de prolaminas |
€ / muestra |
42.79 € |
46.87 € |
| Procesado de muestras |
€ / muestra |
39.12 € |
42.84 € |
| Extracción de gliadinas y gluteninas |
€ / muestra |
42.79 € |
46.87 € |
| Análisis HPLC: total prolaminas completo |
€ / muestra |
141.22 € |
154.67 € |
| Análisis HPLC: proteínas del gluten (gliadinas y gluteninas) |
€ / muestra |
82.36 € |
90.21 € |
| Análisis HPLC: Gliadina y Glutenina completo |
€/ muestra |
153.57 € |
168.2 € |