Identificación de proteínas por LC-ESI-MS/MS

Descripción del servicio

La identificación y caracterización masiva de proteinas se lleva a cabo mediante nanocromatografia (que puede ser multidimensional) acoplada mediante una fuente nanospray a un espectrómetro de masas de alta resolucion Thermo Orbitrap Exploris OE240. La duración del gradiente cromatográfico (tipicamente ultracorto, corto, medio o largo) y el tipo de espectrómetro de masas empleado se decide en función de la complejidad estimada de la muestra a analizar, el número de identificaciones esperado, el grado de resolución y precisión de masa requerido y finalmente la sensibilidad necesaria. Los costes del servicio se ajustan en función de estos parámetros.

Descripción del servicio

A partir de una mezcla de proteínas de diversa complejidad (bandas de geles 1D, inmunoprecipitaciones, proteomas complejos, etc.) se lleva a cabo su identificación. Para ello, las proteínas son digeridas con una enzima, y los péptidos resultantes son analizados por cromatografía líquida de fase reversa acoplada a espectrometría de masas (nLC-msms). La digestión enzimática se realiza tanto a partir del recorte de una banda de un gel teñido, como a partir de proteínas en disolución previamente cuantificadas. Tras la digestión y antes de la introducción de la muestra en el cromatógrafo, se realiza la extracción peptídica y/o la limpieza de la muestra con resinas C18 (SPE). Para la separación cromatográfica se utiliza el equipo de nanocromatografía Easy-nLC II (Proxeon) con una columna C18 de 15 cm de longitud, y un gradiente cuya duración dependerá del grado de complejidad de la muestra, siendo de 10-20 min para una proteína purificada, 30-60 min para muestras sencillas (<5 proteínas), de 90-120 min para muestras de media complejidad (<50 proteínas), y de 150-180 min para muestras complejas (>50 proteínas). La salida del cromatógrafo está acoplada por medio de una fuente nano-electrospray (CaptiveSpray) al espectrómetro de masas de baja resolución de Trampa de Iones (IT) Amazon Speed ETD (Bruker), en el que se realizan ciclos de escaneado de masas (MS) de los péptidos eluidos ionizados, seguido de la selección automática y fragmentación (MS/MS) de los 3-10 péptidos más abundantes detectados en el ciclo anterior, con resoluciones de 0,3 a 0,5 uma. A partir de los datos de masas de los péptidos fragmentados se realiza la búsqueda en las bases de datos (SwissProt, Trembl, NCBI u otras especificadas por el usuario) utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science) integrado en otros programas informáticos como ProteinScape y BioTools (Bruker). El procedimiento estándar incluiría: - Carga de proteínas en gel, tinción con azul Coomassie y recorte manual de las bandas teñidas (si se realiza digestión en gel). - Reducción y carbamidometilación de proteínas. - Digestión de las proteínas con tripsina. - Limpieza con resina C18 (SPE) (si se realiza digestión en disolución) - Separación cromatográfica de los péptidos. Obtención de espectros de masas y de fragmentación de péptidos. - Procesado de datos de masas e identificación de proteínas en bases de datos. - Informe de resultados. INSTRUCCIONES DE ENVÍO DE MUESTRAS A partir de proteínas en GEL: 1.- El usuario deberá enviar el gel en agua Milli-Q (debidamente identificado), revelado con tinciones de Azul Coomassie, Sypro o Plata compatible con espectrometría de masas. Opcionalmente, el usuario puede enviar las bandas de proteínas ya recortadas, en tubos eppendorf de 1,5 ml identificados con el nombre de las muestras en la tapa de los mismos. El tamaño de los recortes de gel debe ajustarse a la zona teñida. 2.- Las muestras se entregarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS). Se deberá adjuntar la imagen del gel indicando las bandas a identificar. En el formulario se indicará la técnica de análisis solicitada, así como una estimación de la cantidad de proteínas. A partir de proteínas en DISOLUCIÓN o LIOFILIZADAS: 1.- Las proteínas en disolución o liofilizadas deberán ir en un tubo de 0,5 ml debidamente identificado con el nombre de la muestra en la tapa del mismo. 2.- Las muestras se entregarán o enviarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS), donde se especificará la concentración estimada de la muestra y la composición del disolvente (la cantidad de proteínas en el caso de muestras secadas o liofilizadas). En el formulario se indicará la técnica de análisis solicitada, así como el grado de complejidad de la muestra.

Descripción del servicio

Los métodos basados en espectrometría de masas para la identificación de proteínas se han convertido en una plataforma estándar en proteómica. Las estrategias más populares basadas en MS comienzan con la digestión proteolítica de las proteínas en péptidos antes de su análisis en el espectrómetro de masas. La digestión de las proteínas en péptidos de un tamaño similar, ayuda a solventar los problemas de solubilidad y manipulación asociados con las proteínas intactas y genera fragmentos de péptidos que son fácilmente ionizables en el espectrómetro de masas. Los iones-péptidos se miden primero como iones de fragmentos intactos, a continuación, seleccionados en base a su valor m/z, se someten a disociación inducida por colisión (CID), en un proceso conocido como espectrometría de masas en tándem (MS / MS). Bajo las condiciones de baja energía empleadas para CID, los péptidos ionizados se fragmentan en patrones predecibles. Debido a que los patrones de fragmentación son predecibles, los espectros teóricos pueden ser construidos a partir de las secuencias en bases de datos de proteínas o de nucleótidos. Los algoritmos informáticos utilizan los patrones de fragmentación CID de los péptidos de la muestra para determinar la secuencia del péptido, y esta información de la secuencia se utiliza para buscar frente a los espectros teóricos generados a partir de bases de datos de nucleótidos y proteínas. La identificación de proteínas se hace mediante la búsqueda de la mejor correlación entre la información de la secuencia obtenida experimentalmente y las secuencias en la base de datos. Instrucciones para el usuario: 1. Correr un gel SDS-PAGE para poder estimar la cantidad de proteína presente en la muestra, la complejidad proteína, el rango dinámico y el nivel de contaminantes. 2. La muestra puede estar en gel o en solución. 3. La cantidad mínima de muestra depende del espectrómetro de masas que se utilice. Procedimiento: Los digeridos de proteínas se analizan mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas LTQ-Velos (Thermo Scientific) o en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap-Velos-Pro (Thermo Scientific). El equipo LTQ-Velos está acoplado a un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) Agilent 1100 y el equipo LTQ-Orbitrap-Velos-Pro está acoplado a un cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC) Easy-nLC II de Proxeon, para la separación de péptidos. La elección del instrumento (determinada por el personal del Servicio de Proteómica) depende del proyecto y de la cantidad de muestra disponible. Normalmente, el gradiente empleado para muestras de baja complejidad (<5 proteínas) es de 90 min, pero, a medida que aumenta la complejidad, se aumentan proporcionalmente los tiempos de gradiente. La identificación de péptidos, a partir de los ficheros raw, se realiza con el programa PEAKS Studio Xpro (Bioinformatics Solutions).