Peptide Mass Fingerprinting MS - MS/MS by MALDI TOF/TOF

Descripción del servicio

A partir de proteínas separadas en geles SDS-PAGE (1D o 2D), o purificadas por cromatografía líquida, se realiza la identificación de las proteínas mediante la obtención de la huella de masas peptídicas (PMF) del digerido enzimático, así como de la fragmentación de péptidos (PFF), en su caso, utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF. El procedimiento estándar incluye: - Recorte automatizado de la banda o mancha ("spot") de las proteínas y su posterior destinción y lavado (si se parte de proteínas separadas en gel). - Reducción y carbamidometilación de proteínas. - Digestión automatizada de las proteínas con tripsina. - Obtención de los espectros de masas. - Procesado de datos de masas e identificación de proteínas en bases de datos (SwissProt, Trembl, NCBI u otras especificadas por el usuario) utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science) integrado con otros softwares como ProteinScape y BioTools (Bruker). - Informe de resultados. INSTRUCCIONES DE ENVÍO DE MUESTRAS A partir de proteínas en GEL: 1.- El usuario deberá enviar el gel en agua Milli-Q (debidamente identificado), revelado con tinciones de azul de Coomassie, Sypro o plata compatible con espectrometría de masas. Opcionalmente, el usuario puede enviar las bandas o manchas de proteínas ya recortadas, en tubos eppendorf de 1,5 ml identificados con el nombre de las muestras en la tapa de los mismos. El tamaño de los fragmentos o recortes de gel debe ser: 1-2 mm de diámetro para las manchas de geles 2D, y 1 x 3 mm para las bandas de geles 1D. 2.- Las muestras se entregarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS). Se deberá adjuntar la imagen del gel indicando las manchas o bandas para identificar, y con referencias de masa molecular y de punto isoeléctrico. A partir de proteínas en DISOLUCIÓN o LIOFILIZADAS: 1.- Las proteínas deberán ir en un tubo de 0,5 ml debidamente identificado con el nombre de la muestra en la tapa del mismo. 2.- Las muestras se entregarán o enviarán junto con la solicitud correspondiente debidamente cumplimentada (SOLICITUD IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR MS o MSMS), donde se especificará la concentración de la muestra y la composición del disolvente (o la cantidad de proteína en el caso de muestras liofilizadas). También se debe indicar el Peso Molecular y el punto Isoeléctrico de la proteína purificada).

Descripción del servicio

A partir del digerido tríptico se puede realizar también la identificación de la proteína mediante huella peptídica (datos MS), combinada o no con la(s) secuencia(s) de péptidos (datos MS/MS). Cuando se requieran espectros de fragmentación (MS/MS), se seleccionarán las 3 masas mayoritarias dentro de cada una de las huellas peptídicas. La identificación de proteínas se realizará combinando ambos tipos de espectros (MS-MS/MS) obtenidos para cada muestra y usando como motor de búsqueda MASCOT (MatrixScience, UK) sobre bases de datos públicas de secuencias de proteína. La fragmentación de los péptidos puede hacerse fácilmente mediante la técnica LIFT (descomposición metaestable) o bien mediante "Collision-Induced Dissociation" (fragmentación de alta energía).

Descripción del servicio

Identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF de proteínas separadas en geles. Esta aproximación se basa en la determinación precisa de las masas de los péptidos obtenidos por digestión enzimática (huella peptídica). Adicionalmente, se puede identificar y caracterizar proteínas mediante la tecnología de ¿tiempo de vuelo¿ en tándem (TOF/TOF) aislando y fragmentando iones peptídicos de interés y determinando las masas de sus correspondientes fragmentos.