Peptide Mass Fingerprinting by MS-MALDI TOF

Descripción del servicio

El enfoque más eficiente para la identificación rápida de proteínas aisladas de organismos secuenciados. El análisis se puede realizar a partir de una solución líquida de la proteína problema o a partir de bandas de proteínas separadas por electroforesis en gel. En este segundo caso, las manchas/ bandas con las proteínas diana se cortan del gel y las proteínas se digieren in situ con una enzima específica, generalmente tripsina. A continuación, los péptidos de digestión se extraen y analizan por MALDI TOF MS. MALDI TOF MS Una alícuota del digerido proteico se coloca en una placa MALDI donde se mezcla con una matriz (ácido alfa-ciano-4 -hidroxicinamico habitualmente) y se deja secar. La muestra cristalizada se analiza en un espectrómetro de masas MALDI -TOF (4800 TOF/TOF, ABSciex) utilizando el modo reflector de iones positivos . El análisis se realiza en modo automático promediando los espectros obtenidos a partir de 4000-5000 disparos en el rango de m/z de 750 a 4500. Cada espectro se calibra externamente mediante el uso de una mezcla péptidos estándar ( des- Arg1 - bradiquinina (Mr 904.46 ) , Glu1 - fibrinopéptido B (Sr. 1.570,68 ) , la angiotensina - 1 , (Sr. 1.296,69 ) , ACTH 1-17 (Sr. 2.093,09 ) , ACTH 18-39 (Sr. 2.465,20 ) , ACTH 7-38 (Sr. 3.657,93 ) y , cuando es posible , una calibración interna usando los iones derivados de la auto-digestión con tripsina (Mr 842,5100 , 1045,5642 , 2011,1046 , 2807,3145 y 3337,7577 ). Los espectros obtenidos proveen de la masa exacta de los péptidos de digestión presentes en la muestra. Esta colección de masas de péptidos constituye una huella dactilar de la secuencia de proteína original. Las proteínas se identifican a partir de estas huellas utilizando herramientas bioinformáticas que las comparan con los perfiles esperados a partir de las secuencias en las bases de datos de proteínas. Nota: Cuando la proteína no puede ser identificada vía PMF o se requiere una validación de los datos PMF, es posible realizar un análisis TOF/TOF MS/MS sobre la misma muestra (Ver Peptide Mass Fingerprinting MS - MS/MS BY MALDI TOF/TOF). El digerido proteico puede analizarse también por electrospray MS/MS (Ver LC MS/MS identification and nESI MS/MS identification). Este método es complementario al de MALDI-TOF ya que a menudo aporta una diferente selectividad de ionización así como una mayor eficiencia en la secuenciación. Sin embargo, la identificación mediante ESI MS/MS requiere un tiempo mayor y tiene un mayor coste económico.

Descripción del servicio

A partir de digerido tríptico se realizará el análisis de los péptidos MALDI-TOF MS obteniéndose con ello un espectro característico y único con diferentes fragmentos trípticos que es los que se conoce como mapa o huella peptídica que nos permitirá la identificación de la proteína siempre que se encuentre en la base de datos. La huella peptídica (del inglés peptide mass fingerprinting, PMF) es una técnica analítica para la identificación de proteínas a partir de un digerido tríptico, cuyas masas se pueden medir con precisión mediante MALDI-TOF MS. Estas masas se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas. Las masas absolutas de los péptidos de cada proteína que se calculan teóricamente nos permitirá la comparación de masa entre los péptidos de la proteína desconocida y las masas peptídicas teóricas de cada proteína para encontrar el que se ajusta mejor. El análisis mediante PMF puede realizarse con proteínas en solución o con proteínas procedentes de SDS-PAGE previa modificación química. Las proteínas son digeridas en varios fragmentos mediante enzimas proteolíticas para generar los péptidos que serán analizados. Una pequeña fracción del péptido se deposita sobre la placa MALDI junto con la matriz adecuada y, a continuación las moléculas de la matriz y de péptido co-cristalizan en la placa de MALDI para proceder a su análisis. Tras insertar la placa en la cámara de vacío del espectrómetro de masas, la desorción e ionización de los fragmentos de polipéptido es iniciado por un haz láser. Los iones son acelerados en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde se detecta su llegada como una señal. El análisis de espectrometría de masas nos proporciona una lista de pesos moleculares de los fragmentos. Las masas de péptidos se comparan con bases de datos de proteínas tales como Swissprot, NCBInr, que contienen información de la secuencia de proteínas proporcionándonos posibles coincidencias. El espectrómetro de masas que utilizamos para el análisis es un Autoflex III MALDI-TOF-TOF. Para el procesamiento de los datos se utilizan diferentes software, siendo todos ellos Bruker. La adquisición de espectros de masas se hace con Flex Control, para el procesamiento de espectros y anotaciones usamos el Flex Analysis, y para el procesamiento adicional y búsqueda de datos se utilizan BioTools y Sequence Editor (Bruker). El motor de búsqueda que utilizamos para la identificación de proteínas es MASCOT (MatrixScience, UK).